激光扫描体视显微镜采集的注意事项

激光扫描体视显微镜对于要观察的区域，应先用明视场显微镜和普通荧光显微镜进行定位，当然也可使用共聚焦系统的体视显微镜进行定位。但对于大多数初学者或非专业研究人员来说，在只使用共聚焦模式的情况下，常很难找到合适的焦平面。所以应该学会使用共聚焦系统配备的显微镜，以常规模式预观察样品，因为要在一张含有数百个胚胎的标本中找出特定发育时期的某种基因的表达非常困难，如直接采用共聚焦模式扫描标本，常很费时。许多仪器具备快速扫描功能，可在一定程度上弥补这种缺陷，但在快扫模式下，其分辨率低。因此，当寻找少见的现象时，较容易的方法是使用普通模式观察切片，一旦发现即刻切换到共聚焦模式进行图像采集。

成功进行共聚焦图像采集的关键是掌握透镜NA，针孔大小和图像亮度之间的互相配合，对于亮度，应以可获得最佳图像的最小激光强度为标准，即在保证成像的情况下，激光功率应尽可能小。可使用软件的放大功能放大图像，并将所得的图像与高NA物镜所得的图像进行比较。在体视显微镜特定成像参数的设定操作时，应在标本要观察的特定区域以外进行，防止有价值的区域发生光漂白。常包括设定PMT探测器的增益和背底水平，以及何时的针孔大小，保证在可接受的分辨率和足够的反差之间获得平衡，使用最低的激光功率以避免发生过多的光漂白。许多仪器具有颜色表，有助于设定图像中的正确动态范围。在8比特系统中，该表将最黑的像素设定为0.为伪彩绿色，而最亮的像素设定为255，为伪红色。增益和背底水平以及针孔的调节，使其变化范围在0-255之间，这种调节也可通过肉眼进行。但在进行实际图像采集时，标本的荧光不均匀，可能超出范围，因此，亮的区域可能遮盖暗的区域。

采集的图像常储存在计算机的硬盘中，而后再进行拷贝。通常在图像采集过程中，应采集尽可能多的图像，如果需要删除，可在随后的图像处理过程中删除不满意的图像。有时开始看似不满意的图像，在日后的进一步复审中可能变得价值非凡，因此，在进行图像删除时，应慎之又慎！要与以前制备标本时各项条件保持一致，再复制制备标本非常苦难，有时是不可能的。