本文标题："大肠杆菌中表达和纯化蛋白质载体的特征技术"
发布者：yiyi ------ 分类: 行业动态 ------
人浏览过-----时间：2017-2-26 0:37:10
大肠杆菌中表达和纯化蛋白质载体的特征技术
在原核生物特别是大肠杆菌中表达真核生物的目的基因。纯化出的
蛋白质表达产物是研究蛋白质结构与功能，蛋白质一蛋白质、蛋白
质一核酸间的相互作用，制备抗体及突变研究等的基础，也是基因
克隆的目的所在。在大肠杆菌中表达和纯化蛋白质操作相对简便，
表达效率很高，而且表达量容易控制，因此应用最为广泛。目前蛋
白质表达的方法大多是将编码所需产物的基因插入表达型质粒，然
后将该载体导人细胞。典型的表达载体除具有一般克隆载体的特征
外还包含指导相应mRNA大量合成的启动子、允许其在宿主体内自主
复制的序列和能增强mRNA翻译效率的序列。
1)原核表达载体特点
根据不同需要，人们构建了多种原核表达载体，即在相应的受
体细胞中能表达外源基因的载体，这些原核表达载体通常有如下特
点：①有一个强的原核启动子及其两侧的调控序列；②应有SD序列
，而SD序列与起始密码子AUG之间要有合适的距离；③在克隆基因
与启动子之间应有正确的可读框；④外源基因下游应加入不依赖p
因子的转录终止区。
2)提高外源基因表达水平的措施
只要考虑到表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子、
可读框及宿主调控系统等条件，一般都可使外源基因在原核细胞中
有所表达。但如何使外源基因在原核细胞中获得高效表达仍是需要
努力探索的目标之一。现在可通过以下方法提高基因的表达水平：
①调整SD序列与AUG之间的距离；②用点突变的方法改变某些碱基
，以消除mRNA二级结构，提高翻译的完整性；③在真核基因下游插
入重复性回文序列或其他具有反向重复序列的DNA片段，防止限制
性外切核酸酶的攻击，从而起到稳定mR—NA，提高表达水平的作用
；④通过诱导表达或诱导复制，减轻细胞代谢负荷，提高外源基因
表达效率；⑤在外源蛋白N端加一段原核短肽或采用某种蛋白酶突
变菌株，保护表达蛋白不被降解。
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