本文标题："微生物样品琼脂糖凝胶电泳检测分析显微镜"
发布者：yiyi ------ 分类: 行业动态 ------
人浏览过-----时间：2019-3-30 0:43:7
微生物样品琼脂糖凝胶电泳检测分析显微镜
当降解的DNA成为模板时，由于模板重建形成的竞争，完整模板较低的起始
反应浓度，抑制效应都将导致检测不到PCR产物的存在。较强的或部分的抑
制效应可以按上面讨论过的PCR产物二次纯化加以消除或者用一系列稀释的
提取液作为模板。由于模板的片段性导致的低效率PCR扩增或缺乏产物可以
通过初步的无引物的聚合反应重建及随后的特异PCR加以克服。另外，可以
设计的一组PCR反应，起始PCR反应后所产生的产物作为第二次反应的模板
，而所用的引物是第一次反应引物内侧的引物。
实际的扩增反应必须采用标准的程序，用上述两步嵌合反应的方法，2
5山的反应体系中，包含72．5pmoles的正向和反向引物，0．2mmolesdNTP
，1．25UTaq酶，2．5P，产品供应商提供的?0 X反应缓冲液和2P，的DNA提
取液，MgCI：的浓度必须通过实验决定(尽管3mM是标准的起始反应浓度)。
复性温度，变性、复性和延伸时间取决于热循环仪的机型、目标片段的长
度及引物的不同。尽管理论上说某些具有3+—5’的外切酶活性的DNA聚合
酶利于长片段的扩增和重建，但我们不能证明使用那些酶比标准Taq酶有什
么优越性(Nixon&Golenberg，未发表)。
一次性空气过滤的枪头经常用于防止交叉污染。类似的，所有的试剂
都应该分装成小量，这样可以检查和易于校正任何被污染了的溶液。除了
酶和模板DNA外的所有试剂应混匀，放在冰上，暴露在短波紫外光下使溶液
中任何双链DNA形成嘧啶二聚体。这将阻止潜在污染DNA的扩增。为了避免
接触不必要的污染，首轮PCR反应液可以不作电泳检测在第二轮或者嵌合PC
R反应后进行琼脂糖凝胶电泳检测。在嵌合PCR过程中，第二轮反应的引物
应合成至第一轮反应所用正向引物和反向引物的3+端，加上1 P，的初次反
应产物作模板，并使用50P，的反应体积，以保证足够的PCR产物用于最后
测序，反应温度和时间必须按照新的引物和反应体积加以调整。第二次扩
增以后，用5 P，的反应产物以琼脂糖凝胶和溴化乙锭电泳检测PCR产物的
存在及其片段大小。
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