 来源：腐败产品之铝箔包保久乳来自A厂，调味乳来自B厂。

 

 腐败包内容物直接镜检

 

　　腐败包经摇动混合后，以75% 酒精擦拭包装盒顶，在无菌操作箱中以U. V. 照射表面，按郑等（1997）之方法，将异常品取内容物1 ml，在5 ml无菌水中稀释，于位相差显微镜（OPTIPHOT-2, Nikon）观察腐败菌之形态，并记录腐败产品之特性，如pH值、口味。

 

 腐败产品之取样培养与微生物分离

 

　　以无菌操作法使用无菌吸管吸取0. 2 ml之内容物至nutrient agar（Difco）表面涂抹，在35 ℃培养三天，由nutrient agar之平板上挑出五个菌落，于位相差显微镜下观察是否与直接镜检腐败内容物具有相同细胞形态与菌相。若具运动性，革兰氏阳性，并产生孢子，符合这些条件之菌落，再以API（Analytab Products Inc. ）公司之API 50CHB和API 20E快速检测套组（Logan and Berkeley, 1984），在35 ℃，48小时培养后，观察呈色反应，将结果输入ATB（Automatic Tests in Bacteriology）自动判读系统，鑑定其种名。

 

　

 

二. 孢子悬浮液之制备

 

 一般处理：由腐败保久乳分离鑑定后之菌株B. cereus TP-5以nutrient broth培养隔夜，取0.1 ml涂抹于含10 ppm MnCl2‧4H2O之nutrient agar的平板内（Kim and Naylor, 1966），于35 ℃ 培养4天，在位相差显微镜下观察，孢子完全成熟后再加入无菌水将培养基表面的孢子用涂抹棒将其刮起放入试管中，再用无菌水清洗三次（8000X，离心10分钟），做成孢子悬浮液，然后于85 ℃ 热水中加热12分钟，以杀死营养细胞，并于4 ℃ 冷藏之（Rajkowski and Mikolajcik, 1987）。

 

　

 

 特殊处理：按Gaze et al.（1990）增加细菌孢子之耐热性之方法，将分离株B. cereus TP-5涂抹于产孢之培养基（7.5 g之nutrient agar，含10 ppm MnCl2‧4H2O, 0.8 ml之100 ppm（w/v）之CaCl2 和2.2 M sucrose，溶于300 ml蒸馏水），40 ℃ 培养5天，在位相差显微镜下观察，孢子完全成熟后，用2.2 M sucrose溶液收集，做成孢子悬浮液，然后于85 ℃ 热水中加热12分钟，迅速冷却后，储存于4 ℃ 备用。

 

　

 

三. 孢子耐性测试

 

　　按Russell（1982）之方法将前项已收集好的孢子以0. 067 M磷酸缓衝溶液（phosphate buffer solution）稀释，使每ml约含106个孢子，各装2 ml孢子悬浮液于TDT试管（thermal death time tube），并以火焰封管后，置于恒温油槽中（NESLab, Exacal, EX-251 HT, USA），同一个温度五种不同的加热时间，各取6支试管测试其100 ℃、105 ℃ 和110 ℃ 之孢子耐热性，加热完毕后立即放入冰浴槽中冷却，再以钻石玻璃刀将TDT试管开口打破，孢子悬浮液倒入杀菌过的nutrient broth，并按Ashton（1971）之方法添加0.1% soluble starch（Difco）以增加受伤孢子之回收，在35 ℃ 培养二天，观察试管中微生物有无生长。D值计算根据Stumbo ( 1973a ) 之方法如下：

 

D＝ t /（log a－log b）

 

t：加热时间

 

a：最初细菌孢子数

 

b：残存细菌孢子数

 

　　6支试管全部生长时，则视为每支试管至少有一个以上孢子未被杀死；只有部份生长，部份未生长时，视为有生长的为各由一个残存孢子生长所致，D值为杀菌孢子数90% 所需之时间，Z值为细菌孢子之D值降低90% 时所需温度之差距，亦即细菌孢子死灭速度D值之温度系数。

 

　

 

四. UHT对于B. cereus 孢子之杀菌效果

 

　　将B. cereus TP-5之孢子悬浮液接种至还原乳300 L，使每ml之还原乳中含105～106个之孢子，经由板式热交换机（Sterilab, Vtis, Alfa Laval, Sweden）之加热135 ℃ 或140 ℃，4秒后，以TBA 3充填机（Tetra Pak, Sweden）包装后产品经37 ℃ 保温14天后，检测其包装外观和内容物所产生之腐败现象。

 

　

 

五. CIP清洗与蒸汽预杀菌对于B. cereus孢子之杀菌

 

　　将B. cereus TP-5之孢子悬浮液加入300 L之还原乳，使还原乳之孢子数105 spores/ml，于板式热交换、无菌管路和无菌桶中循环1小时后再以CIP清洗，以热水、碱液、热水、酸液、热水之顺序清洗，先以热水冲洗5分钟，再以1.5% NaOH碱液，80 ℃ 清洗30分钟，热水冲洗后再以1% HNO3，65 ℃ 清洗25分钟，最后以50 ℃ 热水冲洗；隔天生产前，再使用蒸汽杀菌管路，蒸汽维持在121℃，30分钟。蒸汽杀菌后，将无菌桶之阀组与板式热交换机之板片拆卸，以棉花棒涂抹法，按Sveum et al. ( 1992 ) 之方法取板片上有乳垢之处，依CNS 12540仙人掌杆菌之MPN检测法检测，正反应之试管按Holbrook and Anderson（1980）之方法，涂抹至PEMBA（polymyxin pyruvate egg yolk mannitol bromothymol blue agar）（bactopeptone, 0.1%; D-mannitol 1%; MgSO4．7H2O 0.01%; NaCl 0.2%; Na2HPO4 0.25%; KH2PO4 0. 025%; bromothymol blue 0. 012%; agar 1.5 %; pH 7. 2±0. 2）。polymyxin最终浓度为100 unit/ml，培养在35 ℃，48小时，典型菌落为圆锯齿状，绿色菌落之透明外环。由PEMBA之每个平板上挑出三个典型菌落，并在位相差显微镜下观察是否是产孢杆菌，具运动性，并且好气和厌气下都能生长，符合这些条件的菌落，再以API 50CHB和API 20E快速检测套组，在35 ℃，48小时培养后观察呈色反应，将结果输入ATB自动判读系统，鑑定种名，以确定其是否为B. cereus。