受福马林固定和石腊包埋法遮蔽的抗原决定子可以透过酵素消解(enzymatic digestion)、皂素(saponin)或加热的方式露出。请勿与未经石腊包埋的冷冻切片或细胞一同使用。以下摘录不同处理方法:

 

Pronase® 蛋白酶 :室温条件下, 在pH值7.6、含有0.0025% PRONASE® 蛋白酶(Calbiochem Cat. No. 53702)的10 mM Tris 缓衝液中孵育切片。在含有0.2%甘胺酸的PBS溶液中进行清洗以终止消解。

胰蛋白酶: 室温条件下, 使用PBS溶液和0.1%胰蛋白酶(Calbiochem目录编号6502)孵育切片。

使用浓度0.1 mg/mL的黄豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitor, Calbiochem目录编号65035), 在PBS溶液中孵育切片5分钟。

胃蛋白酶:室温条件下, 使用pH值2.3、0.01 N的HCl溶液和0.1%的胃蛋白酶(Calbiochem 目录编号516360)孵育切片。在蒸馏水中反複清洗中止步骤。

皂素: 室温条件下, 使用蒸馏水调配和0.05%的皂素(Calbiochem目录编号558255)孵育切片30分钟。并且在PBS溶液中清洗至少三次。

神经胺酸水解酶: 室温条件下, 使用PBS溶液和0.02 units/mL的神经胺酸水解酶(Neuraminidase, Calbiochem目录编号480717)孵育切片60分钟。在PBS溶液中清洗至少三次。

加热: 95°C条件下, 使用10 mM柠檬酸钠(pH 6.0)缓衝液孵育10分钟。添加初级抗体前让载玻片冷却至室温条件, 并且持续进行染色步骤。备注: 使用压力锅可以得到更好的结果(请参见以下叙述)。

4 N HCl: 37°C条件下使用10 mM柠檬酸钠(pH 6.0)孵育切片10分钟。在蒸馏水中清洗至少三次。

福马林固定和石腊包埋切片的压力锅预处理法:

 

在柠檬酸缓衝液中对福法林固定或石腊包埋的组织切片使用压力锅进行预热处理10分钟, 让抗原位(antigenic site)得以曝露以及减少背景讯号。

 

*进行步骤4和步骤5时请戴上护目镜和防热手套。

 

将载玻片置于含有pH值6.0、200 ml浓度10 mM柠檬酸盐缓衝液的塑胶染色壶(Coplin jar)中。然后将载玻片移至载具上待测。将染色壶上盖松开, 让蒸气得以从空隙逸散。

将1公升的水加入含有一座矮脚蒸架(steaming rack)的压力锅中。然后把压力锅放在实验室加热板上。把染色壶放入压力锅中(最多可同时处理4个染色壶)。上紧压力锅的盖子, 然后把压力平衡砝码放在压力锅盖中央的通风口顶部。

将加热板上的加热设定调整到最高。约30分钟后, 压力锅盖上的砝码会因为蒸气逸散而滚落。此时将加热设定调整到中度范围。计时器设定为10分钟。

10分钟过去后, 把加热板关闭并且小心地将压力锅移到耐热的桌面上。

经过10分钟的冷却, 移去砝码让蒸气得以散逸。当安全锁掉落回原位时, 就可以开启压力锅盖并将染色壶移出。

移出载玻片并让它冷却15分钟。之后将载玻片移入PBS溶液中5分钟。

使用标準实验步骤进行IHC染色。